タヒボNFD特許公報　特許第2669762号

(19)【発行国】日本国特許庁（ＪＰ）
(12)【公報種別】特許公報（Ｂ２）
(11)【特許番号】第２６６９７６２号
(24)【登録日】平成９年（１９９７）７月４日
(45)【発行日】平成９年（１９９７）１０月２９日
(54)【発明の名称】２―（１―ヒドロキシエチル）―５―ヒドロキシナフト〔２，３―ｂ〕フラン―４，９―ジオンを含有する発癌プロモーション阻害剤
(51)【国際特許分類第６版】

   A61K 31/34    ADU         
        35/78                 
   C07D307/92                

【ＦＩ】

   A61K 31/34    ADU         
        35/78        C       
   C07D307/92                

【請求項の数】１
【全頁数】３６
(21)【出願番号】特願平５−３５２５１
(22)【出願日】平成５年（１９９３）２月２４日
(65)【公開番号】特開平６−１４５１６２
(43)【公開日】平成６年（１９９４）５月２４日
【審判番号】平７−８６２２
(31)【優先権主張番号】特願平４−２４９３４０
(32)【優先日】平４（１９９２）９月１８日
(33)【優先権主張国】日本（ＪＰ）
(73)【特許権者】
【識別番号】９９９９９９９９９
【氏名又は名称】タヒボジャパン 株式会社
【住所又は居所】大阪府大阪市中央区平野町１丁目８番３号
(72)【発明者】
【氏名】上田 伸一
【住所又は居所】京都府京都市左京区下鴨泉川町３８−２３
(72)【発明者】
【氏名】徳田 春邦
【住所又は居所】京都府京都市左京区下鴨北園町３
(72)【発明者】
【氏名】平井 圭一
【住所又は居所】石川県金沢市橋場町９−２３ ロワイヤルユー梅の橋７０２
(72)【発明者】
【氏名】畠中 平八
【住所又は居所】兵庫県西宮市剣谷町１２−２１
(74)【代理人】
【弁理士】
【氏名又は名称】青山 葆 （外１名）
【合議体】
【審判長】吉村 康男
【審判官】宮本 和子
【審判官】谷口 浩行
(56)【参考文献】
【文献】特開 昭６３−１９６５７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開 平４−１３９１７７（ＪＰ，Ａ）

(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】 下記構造式で示される２−（１−ヒドロキシエチル）−５−ヒドロキシナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオンを必須成分とする発癌プロモーション阻害剤：【化１】

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、抗癌活性を有する新規化合物およびそれを含有する抗癌剤に関する。
【０００２】癌による死亡者数は年々増加し今日先進国死亡率の最大の原因となっており、癌制圧は医療における最重要課題である。癌の治療において大きなテーマの一つは抗癌剤の開発であり、過去多種多様の抗癌剤が開発されてきた。癌細胞に直接作用し殺細胞性を発揮するものとして多数の抗生物質等が開発されてきたが同時に正常細胞や正常組織に対する毒性も強く、重篤な副作用を招来することが多くの場合避けられなかった。従って効果的な医療を行うために、副作用が少なく癌細胞に対し選択的な細胞毒性を発揮する抗癌剤の開発が待たれている。
【０００３】癌細胞の特性は十分に解明されるに至っていないが、今日、発癌性化学物質、放射線、紫外線あるいは発癌性ウイルス等の刺激によって細胞染色体に潜在する癌遺伝子が発現するか、反対に癌抑制遺伝子が不活性化隠蔽されるために癌遺伝子産物を作り出すようになると考えられている。癌遺伝子産物が細胞内外に分泌されるかあるいは細胞膜に分布するようになることで、癌細胞特有の性質である転移浸潤能や無常軌な増殖能を獲得することと関係があると考えられている。これらの異常に発現した系を断ち切ることが可能になれば癌制圧の有効な手段となることが期待される。
【０００４】一方、従来から、抗癌剤の有効性を調べるために、我国に於いては、米国ＮＣＩ（Ｎational Ｃancer Ｉnstitute）の基準に準拠し、マウス白血病Ｌ１２１０及びＰ３８８細胞を用いたスクリーニングを常法としている。しかし同法における試験成績がヒト癌患者による臨床試験成績と一致することはむしろ少なかった。最近、ＮＣＩはヒト癌細胞株を用いる新スクリーニング方式を採用し、この方式による成績と臨床有効例との間に強い相関があることを認めるに至った（Ｇ.Ｂ.Ｇrindey：Ｃancer Ｃells.２巻６号１６３〜１７１頁、１９９０及び西條長宏：臨床医１７巻６号４〜９頁、１９９１）。
【０００５】本発明者らは、かかるヒト癌細胞を使用する新スクリーニング方式により種々の物質の抗癌作用を調べる内、ノウゼンカズラ科の植物、タヒボ（Ｔabebuia avellanedae Ｌorentz，ex Ｇriseb.）に含まれる新規化合物、２−（１−ヒドロキシエチル）−５−ヒドロキシナフト［２,３−b］フラン−４,９−ジオン（略称：ＮＦＤ）が優れた抗癌作用を有することを見い出した。本発明は、かかる知見に基づき完成されたものである。即ち、本発明は、式：【化２】


で示される新規化合物、ＮＦＤを提供するものである。更に本発明は、ＮＦＤを有効成分として含有する抗癌剤を提供するものである。
【０００６】更に本発明は、タヒボの乾燥樹皮を温メタノールで抽出し、メタノールを留去して得られる残渣をクロロホルムで冷浸し、クロロホルム可溶成分をトルエン／酢酸エチルエステル（４：１）を展開溶媒とするプレパラティブ薄層クロマトグラフィーによって分離することからなるＮＦＤの製造方法を提供するものである。
【０００７】ＮＦＤ（分子式:Ｃ₁₄Ｈ₁₀Ｏ₅；分子量:２５８.２３０）はジメチルスルホキシド、クロロホルムに易溶、水に難溶の、融点１８１℃の黄色針状結晶である。
【０００８】ＮＦＤは、培養ヒト肺腺癌Ａ−５４９細胞、ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞、ＳＫ−ＬＵ−１細胞、ヒト肺扁平上皮癌Ｃalu−１細胞、ヒト結腸腺癌ＷiＤr細胞、ヒト前立腺癌ＬＮＣaＰ細胞、ヒト膣扁平上皮癌Ａ−４３１細胞、ヒト子宮頚癌ＨeＬa細胞、ヒト胆道癌ＨuＣＣ−Ｔ１細胞、マウス皮膚癌メラノーマＢ１６（Ｍ４）細胞、ヒトＢ型悪性リンパ腫細胞、ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞、ヒト膵臓癌ＡＳＰＣ−１細胞、ヒト神経芽腫ＩＭＲ−１３２細胞、ヒト肺小細胞癌ＳＣＣＨ−１９４細胞、ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞、ヒト腎癌ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞、ヒト胃癌ＮＵＧＣ−２細胞、ヒト甲状腺癌８３０５Ｃ細胞、ヒト乳癌ＭＲＫ−nu−１細胞、ヒト肝癌ＨuＨ−７細胞、ヒト卵巣癌ＴＹＫ−nu細胞、ヒト絨毛上皮癌ＢeＷo細胞等に対し低濃度でその増殖を強く阻害し、さらにこれらの腫瘍細胞に対し選択的な毒性を有する。
【０００９】上記の悪性腫瘍細胞に対するＬＤ₅₀値（５０％増殖阻害値：ＩＣ₅₀値と同意）はほぼ５.５〜２５ng／mlの範囲にある。一方、培養ヒト正常線維芽細胞Ｎ６ＫＡ細胞、ヒト正常気管上皮細胞、ヒト正常腎細胞及びヒト正常リンパ球に対するＬＤ₅₀値（ＩＣ₅₀値）は５５〜８４ng／mlの範囲にある。ＩＣＲマウス（雄）に対し腹腔内投与による毒性ＬＤ₅₀値は０.７３mg／１００g体重、経口投与による毒性ＬＤ₅₀値は０.８４mg／１００g体重である。
【００１０】以上述べたことから明らかな様に、ＮＦＤは種々の癌に対し安全に使用することができる極めて優れた抗癌剤である。尚、ＮＦＤは、正常細胞が化学発癌物質やウイルスによって癌細胞に移行する際の重要な過程であるプロモーション段階に作用し、抗発癌プロモーターとしての機能をも有することがわかった。従って、本明細書に於いて抗癌剤とは、固形癌、血液癌、肉腫などのあらゆる悪性腫瘍に対して有効に作用し、これを治癒、軽減せしめると共に、これらの悪性腫瘍の発生を防止する薬剤を意味するものとする。以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
【００１１】実施例１ ＮＦＤの製造タヒボの乾燥樹皮（ブラジル産；タヒボジャパン株式会社より販売）１kgを細切し、メタノール１０００ml宛で３０分３回加熱還流下に抽出、溶媒を減圧留去した。残渣（１４５g）をクロロホルム４００ml宛で３回冷浸し、クロロホルム層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して残渣１gを得た。これをトルエン・酢酸エチルエステル（４：１）を展開溶媒として、厚さ０.５mmのシリカゲル６０Ｆ₂₅₄を用いてプレパラティブ薄層クロマトグラフィーを行い、Ｒf＝０.２４のスポットをかきとり、クロロホルム−メタノール（容積比９：１）で抽出してＮＦＤを得た。この薄層クロマトグラフィーを反復し、計０.８mgのＮＦＤを得た。融点１８１℃。
【００１２】実施例２ ヒト固形癌細胞、血液癌細胞、肉腫等を含む悪性腫瘍に対するＮＦＤの抗癌作用（１）試料の調製秤量したＮＦＤをＤＭＳＯに溶解し、１.０mg／ml原液を調製し、必要により随時希釈して使用した。
【００１３】（２）ＮＦＤの抗癌性（増殖抑制及び致死作用）試験ＮＦＤによるヒト癌細胞（一部マウス癌細胞を含む）に対する抗癌作用は下記の方法で試験した。対数増殖期後半のヒト肺腺癌Ａ−５４９細胞、ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞、ＳＫ−ＬＵ−１細胞、ヒト肺扁平上皮癌Ｃalu−１細胞、ヒト結腸腺癌ＷiＤr細胞、ヒト前立腺癌ＬＮＣaＰ細胞、ヒト膣扁平上皮癌Ａ−４３１細胞、ヒト子宮頚癌ＨeＬa細胞、ヒト胆道癌ＨuＣＣ−Ｔ１細胞、マウス皮膚癌メラノーマＢ１６（Ｍ４）細胞、ヒト膵臓癌ＡＳＰＣ−１細胞、ヒト神経芽腫ＩＭＲ−１３２細胞、ヒト肺小細胞癌ＳＣＣＨ−１９４細胞、ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞、ヒト腎癌ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞、ヒト胃癌ＮＵＧＣ−２細胞、ヒト甲状腺癌８３０５Ｃ細胞、ヒト肝癌ＨuＨ−７細胞、ヒト卵巣癌ＴＹＫ−nu細胞、ヒト絨毛上皮癌ＢeＷo細胞をトリプシン処理（０.２５％トリプシンと０.０２％ＥＤＴＡを含む、３７℃、３分間）により採取したものを用い、ヒト乳癌ＭＲＫ−nu−１細胞、ヒトＢ型悪性リンパ腫細胞及びヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞は浮遊培養により採取したものを用いた。一方、正常細胞については、対数増殖期後期の線維芽細胞Ｎ６ＫＡ細胞はトリプシン処理により採取したものを用い、正常気管上皮細胞及び正常腎細胞は直接採取したものを用い、正常リンパ球は健常成人末梢血から採取したものを用いた。これらの細胞を９６穴マイクロプレートに５〜１０×１０³細胞／cm²の密度になるように１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地等を用いて播種し、定法に従って２４時間培養した。培養後ＤＭＳＯに溶解したＮＦＤを各々一定量添加して、２４、４８、７２時間後の生細胞数を調べた。なお、ＮＦＤの溶媒であるＤＭＳＯの影響を避けるため、ＤＭＳＯの最終濃度が毒性のない０.５％以下になるように配慮し、ＤＭＳＯのみを添加したものをコントロールとした。
【００１４】（３）生細胞数の計測９６穴マイクロプレート上で増殖した細胞をトリプシン処理で採取し、これに０．２５％トリパンブルーを加えた時、染色されない細胞を生細胞とし、青く染色される細胞を死細胞とした（トリパンブルー排除法）。
【００１５】（４）試験した癌細胞及び正常細胞a）ヒト肺腺癌（Ａ−５４９細胞）
ヒト肺腺癌Ａ−５４９細胞は、Ｆlow Ｌabo Ｉnc.から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００１６】b）ヒト肺腺癌（ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞）
ヒト肺腺癌ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞は、国立衛生試験所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００１７】c）ヒト肺腺癌（ＳＫ−ＬＵ−１細胞）
ヒト肺腺癌ＳＫ−ＬＵ−１細胞は、（財）放射線影響研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００１８】d）ヒト肺扁平上皮癌（Ｃalu−１細胞）
ヒト肺扁平上皮癌Ｃalu−１細胞は、（財）放射線影響研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００１９】e）ヒト結腸腺癌（ＷiＤr細胞）
ヒト結腸腺癌ＷiＤr細胞は、食品薬品安全センター、秦野研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００２０】f）ヒト前立腺癌（ＬＮＣaＰ細胞）
ヒト前立腺癌ＬＮＣaＰ細胞は、香川医科大学内分泌内科学教室から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００２１】g）ヒト膣扁平上皮癌（Ａ−４３１細胞）
ヒト膣扁平上皮癌Ａ−４３１細胞は、金沢医科大学生化学教室から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００２２】h）ヒト子宮頚癌（ＨeＬa細胞）
ヒト子宮頚癌ＨeＬa細胞は、Ｆlow Ｌabo Ｉnc.から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＳＯ培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００２３】i）ヒト胆道癌（ＨuＣＣ−Ｔ１細胞）
ヒト胆道癌ＨuＣＣ−Ｔ１細胞は、金沢医科大学生化学教室から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００２４】j）マウス皮膚癌（メラノーマ）
マウス皮膚癌メラノーマＢ１６（Ｍ４）細胞は、金沢医科大学生化学教室から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００２５】k）ヒト悪性リンパ腫ヒトＢ型悪性リンパ腫細胞は、金沢医科大学内科学教室から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００２６】l）ヒト慢性骨髄性白血病（Ｋ５６２細胞）
ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞は、金沢医科大学内科学教室から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００２７】m）ヒト膵臓癌（ＡＳＰＣ−１細胞）
ヒト膵臓癌ＡＳＰＣ−１細胞は、Ｆlow Ｌabo.社から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００２８】n）ヒト神経芽腫（ＩＭＲ−１３２細胞）
ヒト神経芽腫ＩＭＲ−１３２細胞は、国立衛生試験所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（１％ＮＥＡＡ、５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００２９】o）ヒト肺小細胞癌（ＳＣＣＨ−１９４細胞）
ヒト肺小細胞癌ＳＣＣＨ−１９４細胞は、（財）放射線影響研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＥＳ培地（６０μg／ml硫酸カナマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００３０】p）ヒト膀胱癌（Ｔ２４細胞）
ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞は、横浜市立大学木原生物学研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に継代培養したものを用いた。
【００３１】q）ヒト腎癌（ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞）
ヒト腎癌ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞は、（財）放射線影響研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地（１％ＮＥＡＡ、４mＭ ＨＥＰＥＳを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３２】r）ヒト胃癌（ＮＵＧＣ−２細胞）
ヒト胃癌ＮＵＧＣ−２細胞は、（財）放射線影響研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（４mＭ ＨＥＰＥＳを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３３】s）ヒト甲状腺癌（８３０５Ｃ細胞）
ヒト甲状腺癌８３０５Ｃ細胞は、（財）放射線影響研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地（１％ＮＥＡＡ、４mＭ ＨＥＰＥＳを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３４】t）ヒト乳癌（ＭＲＫ−nu−１細胞）
ヒト乳癌ＭＲＫ−nu−１細胞は、東京大学医科学研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭ−１６０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３５】u）ヒト肝癌（ＨuＨ−７細胞）
ヒト肝癌ＨuＨ−７細胞は、岡山大学癌源研究施設から入手し、１％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（０.２％ラクトアルブミン水解物を含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３６】v）ヒト卵巣癌（ＴＹＫ−nu細胞）
ヒト卵巣癌ＴＹＫ−nu細胞は、（財）食品薬品安全センター秦野研究所から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３７】w）ヒト絨毛上皮癌（ＢeＷo細胞）
ヒト絨毛上皮癌ＢeＷo細胞は、国立衛生試験所から入手し、１５％胎仔牛血清を含むＨam's Ｆ１２（Ｋ）培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３８】x）ヒト正常線維芽細胞（Ｎ６ＫＡ細胞）
ヒト正常線維芽細胞Ｎ６ＫＡ細胞は、金沢医科大学生化学教室から入手し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００３９】y）ヒト正常気管上皮細胞ヒト正常気管上皮細胞は、金沢医科大学病院病理剖検材料から気管上皮をトリプシン処理で採取し、１０％胎仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（５０ＩＵ／mlペニシリン及び５０μg／mlストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００４０】z）ヒト正常末梢血リンパ球ヒト正常末梢血リンパ球は、健常成人男子の末梢血から、Ｆicoll−Ｈypaque遠心法にてリンパ球画分を採取した。この細胞を９６穴マイクロプレートに５×１０³細胞／cm²の密度になるように１０％胎仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００４１】aa）ヒト正常腎細胞ヒト正常腎細胞は、金沢医科大学病院泌尿器科において腫瘍等でネフレクトミーされた腎材料から正常腎細胞をコラゲナーゼ処理で採取し、１０％胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地（１％ＮＥＡＡ、４mＭ ＨＥＰＥＳ及び６０μg／ml硫酸カナマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ₂条件下に培養したものを用いた。
【００４２】（５）実験成績上に列挙した各種悪性腫瘍およびヒト正常細胞に対するＮＦＤの作用（増殖抑制作用及び致死作用）を９６穴マイクロプレートでの生細胞数を測定することにより調べた。尚、コントロールとして、ＮＦＤを含まない培地での細胞の増殖を調べた。その結果を図１〜２７に示す。尚、各図に於ける記号の意義は以下の通りである。
【００４３】図１中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.６ng／ml、□−□は１１.２ng／ml、■−■は２２.４ng／ml、△−△は３３.５ng／ml、▲−▲は４４.７ng／mlのＮＦＤ添加を示す。
【００４４】図２中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.６ng／ml、□−□は１６.８ng／ml、■−■は２７.９ng／ml、△−△は４４.７ng／ml、▲−▲は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。
【００４５】図３中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１１.２ng／ml、□−□は２２.４ng／ml、■−■は３３.５ng／ml、△−△は４４.７ng／ml、▲−▲は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。
【００４６】図４中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１１.２ng／ml、□−□は２２.４ng／ml、■−■は３３.５ng／ml、△−△は４４.７ng／ml、▲−▲は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１R>１〜４に示されるように１１.２〜１６.８ng／mlのＮＦＤによってヒト肺癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、３３.５〜５５.４ng／mlの濃度でほとんどすべての癌細胞が壊死することが確認された。
【００４７】図５中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１１.２ng／ml、□−□は２２.４ng／ml、■−■は３３.５ng／ml、△−△は４４.７ng／ml、▲−▲は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図５R>５に示されるように２２.４〜３３.５ng／mlのＮＦＤによってヒト結腸腺癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、４４.７〜５５.９ng／mlの濃度でほとんどすべての癌細胞が壊死することが確認された。
【００４８】図６中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１１.２ng／ml、□−□は２２.４ng／ml、■−■は３３.５ng／ml、△−△は４４.７ng／ml、▲−▲は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図６R>６に示されるように１１.２ng／mlのＮＦＤによってヒト結腸腺癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、２２.４〜５５.９ng／mlの濃度でほとんどすべての癌細胞が壊死することが確認された。
【００４９】図７中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１６.８ng／ml、□−□は２２.８ng／ml、■−■は２７.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図７に示されるように２７.９ng／mlのＮＦＤによってヒト膣扁平上皮癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制されることが確認された。
【００５０】図８中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.６ng／ml、□−□は１１.２ng／ml、■−■は１６.８ng／ml、△−△は２２.４ng／ml、▲−▲は２７.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図８に示されるように２２.４ng／mlのＮＦＤによってヒト子宮頚癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、２７.９ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００５１】図９中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１１.２ng／ml、□−□は１６.８ng／ml、■−■は２２.４ng／ml、△−△は２７.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図９に示されるように２２.４ng／mlのＮＦＤによってヒト胆道癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、２７.９ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００５２】図１０中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.６ng／ml、□−□は１１.２ng／ml、■−■は１６.８ng／ml、△−△は２２.４ng／ml、▲−▲は３３.５ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１０１０に示されるように１１.２ng／mlのＮＦＤによってマウス皮膚癌メラノーマ細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、１６.８〜３３.５ng／mlの濃度でほとんどすべての癌細胞が壊死することが確認された。
【００５３】図１１中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１１.２ng／ml、□−□は２２.４ng／ml、■−■は３３.５ng／ml、△−△は４４.７ng／ml、▲−▲は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１１に示されるように１１.２〜５５.９ng／mlのＮＦＤによってヒトＢ型悪性リンパ腫細胞は壊死することが確認された。
【００５４】図１２中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１１.２ng／ml、□−□は２２.４ng／ml、■−■は２７.９ng／ml、△−△は３３.５ng／ml、▲−▲は４４.７ng／ml、×−×は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１２に示されるように１１.２〜２２.４ng／mlのＮＦＤによってヒト慢性骨髄性白血病細胞の増殖は抑制され、２７.９〜５５.９ng／mlのＮＦＤによって壊死することが確認された。
【００５５】図１３中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.６ng/ml、□−□は１１.２ng／ml、■−■は２２.４ng／ml、△−△は２７.９ng／ml、▲−▲は３３.５ng／ml、×−×は４４.７ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１３に示されるように３３.５ng／mlのＮＦＤによってヒト膵臓癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、４４.７ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００５６】図１４中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.６ng／ml、□−□は１６.８ng／ml、■−■は２７.９ng／ml、△−△は４４.７ng／ml、▲−▲は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１４１４に示されるように４４.７ng／mlのＮＦＤによってヒト神経芽腫細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、５５.９ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００５７】図１５中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１０ng／ml、□−□は２０ng／ml、■−■は３０ng／ml、△−△は４０ng／ml、▲−▲は５０ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１５に示されるように３０ng／mlのＮＦＤによってヒト肺小細胞癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、４０〜６０ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００５８】図１６中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.７ng／ml、□−□は１１ng／ml、■−■は２３ng／ml、△−△は４６ng／ml、▲−▲は６８ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１６に示されるように２３ng／mlのＮＦＤによってヒト膀胱癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、４６ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００５９】図１７中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１７ng／ml、□−□は３３ng／ml、■−■は５０ng／ml、△−△は９０ng／ml、▲−▲は２８０ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１７に示されるように１７ng／mlのＮＦＤによってヒト腎癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、５０ng／mlの濃度でほとんどすべての癌細胞が壊死することが確認された。
【００６０】図１８中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１７ng／ml、□−□は３３ng／ml、■−■は５０ng／ml、△−△は９０ng／ml、▲−▲は１７０ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１８に示されるように３３ng／mlのＮＦＤによってヒト胃癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、５０ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００６１】図１９中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１７ng／ml、□−□は３３ng／ml、■−■は５０ng／ml、△−△は９０ng／ml、▲−▲は２８０ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図１９に示されるように２８ng／mlのＮＦＤによってヒト甲状腺癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、５１ng／mlの濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００６２】図２０中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１７ng／ml、□−□は３３ng／ml、■−■は５０ng／ml、△−△は９０ng／ml、▲−▲は２８０ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図２０に示されるように３３ng／mlのＮＦＤによってヒト乳癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、５０ng／ml以上の濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００６３】図２１中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.０ng／ml、□−□は７.５ng／ml、■−■は２０ng／ml、△−△は３０ng／ml、▲−▲は４０ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図２１に示されるように２０ng／mlのＮＦＤによってヒト肝癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、３０ng／ml以上の濃度で癌細胞が壊死することが確認された。
【００６４】図２２中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１０ng／ml、□−□は２０ng／ml、■−■は４０ng／ml、△−△は６０ng／ml、▲−▲は８０ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図２２に示されるように２０ng／mlのＮＦＤによってヒト卵巣癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、４０ng／ml以上の濃度でほとんどすべての癌細胞が壊死することが確認された。
【００６５】図２３中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５.７ng／ml、□−□は１１.４ng／ml、■−■は２２.８ng／ml、△−△は３４.３ng／ml、▲−▲は４５.７ng／mlのＮＦＤ添加を示す。図２３２３に示されるように３４.３ng／mlのＮＦＤによってヒト絨毛上皮癌細胞の増殖はほとんど完全に抑制され、４５.７ng／mlの濃度で壊死することが確認された。
【００６６】図２４中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。
【００６７】図２５中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。
【００６８】図２６中、○−○はＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は１６.８ng／ml、□−□は３３.５ng／ml、■−■は５５.９ng／mlのＮＦＤ添加を示す。
【００６９】図２７中、○−○はＨＮＦＤを含まないコントロール（Ｃ）、●−●は３０ng／ml、□−□は５０ng／ml、■−■は１００ng／mlのＨＮＦＤ添加を示す。図２７に示されるように、１００ng／mlのＮＦＤによって正常腎細胞の増殖が抑制されるのみであった。図２４R>４、２５、２６、２７に示されるように、前記癌細胞を死滅させる濃度のＮＦＤによってはヒト正常線維芽細胞、ヒト正常気管上皮細胞、ヒト正常末梢血リンパ球、ヒト正常腎細胞の増殖は抑制されないこと、また死に至らないことが確認された。
【００７０】（６）５０％増殖阻害濃度（ＬＤ₅₀、ＩＣ₅₀値）
図１〜１２の培養３日目に於けるコントロール（ＮＦＤ無添加）に対するＮＦＤ添加時の生存細胞数の割合による各癌細胞の生存率から、増殖を５０％阻害するＮＦＤ濃度（ＬＤ₅₀、ＩＣ₅₀値）を求め、表１にまとめた。
【００７１】
【表１】
ＮＦＤのヒト、マウス悪性腫瘍及び正常細胞に対する５０％増殖阻害濃度（ＬＤ₅₀値、ＩＣ₅₀値）
細胞名 ＬＤ₅₀（ＩＣ₅₀)（ng／ml）ヒト肺腺癌Ａ−５４９細胞 ９.５ヒト肺腺癌ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞 １３ヒト肺腺癌ＳＫ−ＬＵ−１細胞 １７ヒト肺扁平上皮癌Ｃalu−１細胞 １７ヒト結腸腺癌ＷiＤr細胞 １１ヒト前立腺癌ＬＮＣaＰ細胞 １.７ヒト膣扁平上皮癌Ａ−４３１細胞 ２１ヒト子宮頚癌ＨeＬa細胞 １８ヒト胆道癌ＨuＣＣ−Ｔ１細胞 ２０マウス皮膚癌メラノーマＢ１６（Ｍ４）細胞 ６.７ヒトＢ型悪性リンパ腫細胞 ５.６ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞 １４ヒト膵臓癌ＡＳＰＣ−１細胞 １７ヒト神経芽腫ＩＭＲ−１３２細胞 １０ヒト肺小細胞癌ＳＣＣＨ−１９４細胞 １０ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞 ２１ヒト腎癌ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞 １９ヒト胃癌ＮＵＧＣ−２細胞 １７ヒト甲状腺癌８３０５Ｃ細胞 ２５ヒト乳癌ＭＲＫ−nu−１細胞 １２ヒト肝癌ＨuＨ−７細胞 ５.５ヒト卵巣癌ＴＹＫ−nu細胞 １７ヒト絨毛上皮癌ＢeＷo細胞 １８−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ヒト正常線維芽細胞Ｎ６ＫＡ細胞 ８４ヒト正常気管上皮細胞 ＞５５ヒト正常末梢血リンパ球 ８４ヒト正常腎細胞 ６５ 【００７２】その結果、上記実験に用いた癌腫、血液癌に対するＬＤ₅₀値はすべて５.５〜２５ng／mlの範囲にあった。図１３〜１５の培養３日目に於ける正常細胞に対するＮＦＤのＬＤ₅₀値も表１に示してあり、およそ５５〜８４ng／mlの範囲と計算された。
【００７３】実施例３ マウスの肺二段階発癌抑制試験動物実験として雌ＩＣＲマウスを用い、１５匹を１つのケージに入れて自由に固形飼料と飲料水を摂取できる状態に維持し、実験をすすめた。実験前一週間飼育した後、まず６週齢のマウス背部に４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド（４ＮＱＯ）をオリーブ油とコレステロール（２０：１）の溶液に溶かした試薬を体重あたり１０mg／kgの量で皮下注射し、その５週間後から８％グリセロールを発癌プロモーターとして自由に経口摂取させた。陽性のコントロール実験は、４ＮＱＯ処理と８％グリセロールを摂取した群として、被験化合物の群は、０.１ng／mlＮＦＤを含む８％グリセロール液としたものを自由摂取させ２５週間実験を行った。実験開始３０週間目において、頚部脱臼後、剖検にて肺をホルマリン固定して取り出した。実体顕微鏡下において、肺に発現した腺腫を観察その数を計算し、陽性コントロール群とＮＦＤを摂取させた群と比較した。表２が判定に用いた結果である。表２の結果から実験開始後３０週の段階でＮＦＤを摂取させた実験群は陽性コントロールに比べ、腺腫の発現が１／３に減少し有意に肺腺腫形成を抑制した。
【００７４】
【表２】
マウス肺における腺腫の発現数と発現率 実験群 発現した マウス一匹あたり 腺腫が発現した 腺腫数 の腺腫数 マウスの率 Ｉ 飲料水として ０ ０ ０ 水のみ摂取II 飲料水として８％ ０ ０ ０ グリセロールのみ摂取III ４ＮＱＯを摂取後 ３ ０.２ １３.３ 飲料水として水のみ摂取IV ４ＮＱＯを摂取後 ４８ ３.２ １００ 飲料水として8% グリセロールのみ摂取Ｖ ４ＮＱＯを摂取後 ９ ０.６ ３３.３ 0.1ng/ml NFDを含む 8%グリセロール溶液 とし経口摂取させた 【００７５】実施例４ マウス皮膚二段階発癌抑制試験動物実験として雌ＩＣＲマウスを用い、１５匹を１つのケージに入れて実験終了まで、自由に市販の固形飼料と飲料水を摂取できる状態に維持し実験を進めた。６週齢のマウス購入後、その背部を剃毛、次の日にイニシエーターとして３９０nmolの７,１２−ジメチルベンズ(a)アントラセン（ＤＭＢＡ）を０.１mlのアセトン溶液として剃毛箇所に塗布した。１週間後から、同じ箇所にプロモーターとして、１.７nmolの１２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセトート（ＴＰＡ）を同じく０.１mlのアセトン溶液として週二回塗布し、この操作を２０週間連続して続けた。被験試薬としてそれぞれプロモーター処理の１時間前に０.１mlのアセトンを塗布する群と８５nmolのＮＦＤを０.１mlのアセトン溶液として塗布の群を、１群を１５匹として実験を行いＮＦＤで処理した群の抑制効果を観察した。
【００７６】それぞれの結果の判定は週に１回、１mm以上の乳頭腫について、各群のマウスの匹数あたり乳頭腫を有するマウスの匹数を百分率で示した値と、マウスあたりの発現した乳頭腫の数について行った。図２８がその結果でＮＦＤの作用を示し、図２９は比較被験試薬であるラパコールの作用を示す。
【００７７】以上の実施例３および４から、ＮＦＤは発癌プロモーション阻害剤として使用することができ、癌予防薬として使用することが可能であることが判明した。ＮＦＤを抗癌剤として使用するには、１日３回の経口投与が望ましい。１日の投与量は、成人では０.１５〜１.５mgであり、小児では約半量、乳幼児は６分の１量であることが望ましい。投与方法は経口、非経口投与のいずれも可能であるが前者が好ましい。
【００７８】製造例ＮＦＤ１.５mgに対し、賦形剤として乳糖６６.５mg、結合剤としてデンプンのり１０mg、崩壊剤としてデンプン２０mg、滑沢剤としてステアリン酸マグネシウム２mgを加え、よく混合して打錠する。ＮＦＤ１.５mgを含有する１００mgの錠剤を得る（合計１００mg）。

【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト肺腺癌Ａ−５４９細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２】 ヒト肺腺癌ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図３】 ヒト肺腺癌ＳＫ−ＬＵ−１細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図４】 ヒト肺扁平上皮癌Ｃalu−１細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図５】 ヒト結腸腺癌ＷiＤr細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図６】 ヒト前立腺癌ＬＮＣaＰ細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図７】 ヒト膣扁平上皮癌Ａ−４３１細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図８】 ヒト子宮頚癌ＨeＬa細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図９】 ヒト胆道癌ＨuＣＣ−Ｔ１細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１０】 マウス皮膚癌メラノーマＢ１６（Ｍ４）細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１１】 ヒトＢ型悪性リンパ腫細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１２】 ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１３】 ヒト膵臓癌ＡＳＰＣ−１細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１４】 ヒト神経芽腫ＩＭＲ−１３２細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１５】 ヒト肺小細胞癌ＳＣＣＨ−１９４細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１６】 ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１７】 ヒト腎癌ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１８】 ヒト胃癌ＮＵＧＣ−２細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図１９】 ヒト甲状腺癌８３０５Ｃ細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２０】 ヒト乳癌ＭＲＫ−nu−１細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２１】 ヒト肝癌ＨuＨ−７細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２２】 ヒト卵巣癌ＴＹＫ−nu細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２３】 ヒト絨毛上皮癌ＢeＷo細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２４】 ヒト正常線維芽細胞Ｎ６ＫＡ細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２５】 ヒト正常気管上皮細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２６】 ヒト正常末梢血リンパ球細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２７】 ヒト正常腎細胞に対するＮＦＤの増殖阻害及び致死作用を示すグラフ。
【図２８】 ＮＦＤによる発癌プロモーション抑制効果を示すグラフ。
【図２９】 比較被験試薬であるラパコールによる発癌プロモーション抑制効果を示すグラフ。

【図１】


【図２】


【図３】


【図４】


【図５】


【図６】


【図７】


【図８】


【図９】


【図１０】


【図１１】


【図１２】


【図１３】


【図１４】


【図１５】


【図１６】


【図１７】


【図１８】


【図１９】


【図２０】


【図２１】


【図２２】


【図２３】


【図２４】


【図２５】


【図２６】


【図２７】


【図２８】


【図２９】